LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA EKSTRAKSI DNA dan ELEKTROFORESIS

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

EKSTRAKSI DNA dan ELEKTROFORESIS

Di Susun oleh

Nama              : Dimas Wahyu Indrata

NIM               : 1501070011

Prodi/Kelas     : pendidikan Biologi / 3A

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

2016

EKSTRAKSI DNA dan ELEKTROFORESIS

I.     Tujuan

1.      Untuk mengetahui proses mengisolasi DNA

2.      Untuk mengemati ekstraksi daun kelapa

3.      Untuk mengamati DNA dengan menggunakan tehnik elektroforesis

II.  Dasar teori

            DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoxiribosa, basa nitrogen dan zat yang tergabung membentuk nukleotida. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan dinukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun helix ganda, dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam  pasangan yang tetap melalui ikatan hydrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat didalam setiap sel mahluk hidup da disebut sebagai cetak biru kehidupan, karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menetukan struktur protein dan proses metabolisme lain. DNA dapat diisolasi dapat dilakukan dengan tahap-tahap antara lain, preparasi ekstraksi sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA.

            Elektroforesis adalah tehnik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler.

            Elektroforesis gel agarosa adalah tehnik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis prote  dan DNA pada berbagai cairan biologis .teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantuk pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein.

Ada tiga jenis gel yang digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu :

1.      Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer

2.      Gel alkalin agarosa berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar

3.      Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar

Dalam elektroforesis digunakan bahan-bahan seperti etidium bromide yang bersifat karsinogenik. Hal tersebut karena etidium bromide dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas.

            Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetic atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.

III.   Alat dan Bahan

A.    Ekstraksi DNA

Alat

1.      Timbangan

2.      Waterbat

3.      Tabung eppendorf volume 2 ml

4.      Mortar dan pastel

5.      Spatula

6.      Sentrifuge

7.      Micropipet

8.      Blue tip and yellow tip

Bahan

1.      CTAB buffer

2.      Nitrogen cair

3.      CIAA (chloroform isoamyl alcohol 24:1)

4.      Ethanol absolute

5.      TE buffer

B.     Elektroforesis

Alat

1.      Timbangan

2.      Microwafe

3.      Erlenmeyer volume 100 ml

4.      Power supply

5.      Comb

6.      Tray

7.      Micropipette

8.      White tip and yellow tip

9.      PCR tube

IV. Cara Kerja

A.    Ekstraksi DNA

1.      Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2.      Menyiapkan CTAB buffer sebanyak 2x volume berat sample (1ml) dan memasukan ke dalam incubator atau waterbath yang sudah disetting suhunya di 65^oC

3.      Mengambil daun kelapa lalu menimbang beratnya sebanyak 0,5 gram

4.      Memasukan daun kedalam mortar lalu menambahkan nitrogen cair dan digerus sampai halus

5.      Memasukan serbuk daun tersebut menggunakan spatula kedalam tabung eppendorf yang berisi CTAB buffer di atas

6.      Memvortex sebentar

7.      Menginkubasi sample di waterbath/incubator setiap 1 jam, setiap 15 menit di vortex

8.      Mensentrifuge sample dengan kecepatan 11.000 rpm Selama 20 menit

9.      Mengambil supernatan dan memindahkan dalam tabung eppendorf baru

10.  Menambahkan CIAA sebanyak ½ dari volume supernatant lalu diflicking sampai tercampur

11.  Sentrifuge sample lagi dengan kecepatan 11.000 rpm selama 20 menit

12.  Mengambil supernatan dan memasukan ke dalam tube baru, lalu menambahkan 1 ml etanol absolut dan 0,1 ml 7,5 M ammonium acetat dan memficking lagi sampai tercampur

13.  Memasukan sample ke dalam kulkas dan membiarkan selama 24 jam

14.  Setelah 24 jam mensentrifuge sample dengan kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit

15.  Membuang cairan dan kumpulkan DNA yang tertinggal dicuci dengan ethanol 70 % (1ml) lalu mengeringkan sample

16.  Menambahkan TE buffer sebanyak 300 mikroliter dan DNA siap untuk dielektroforesis

B.     Elektroforesis

1.      Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2.      Menimbang agarose sebanyak 1 gram

3.      Mencampurkan agarose dengan TBE buffer sebanyak 100 ml (agarose 1%) di dalam erlenmeyer, menimbang dan mencatat beratnya . lalu memasak agarose menggunakan microwave setelah matang menimbang lagi beratnya, jika berkurang tambahkan TBE buffer sampai mencapai berat semula

4.      Memasukan agarose 1% tadi kedalam cetakan/tray yang sudah dipasang comb tunggu sampai benar-benar padat

5.      Setelah benar-benar padat, mengambil comb sehingga terbentuk sumuran

6.      Memasukan agarose beserta tray nya kedalam elektroforesis chamber ( mengusahakan jangan terbalik posisinya ujung agarose yang ada sumurannya harus berada didepan kutub negatife) lalu menambahkan TBE buffer sampai batas yang sudah ditentukan

7.      Mengeluarkan sample dari kulkas dan memvortex larutan sebentar agar larutan tercampur

8.      Mengambil loading buffer sebanyak 12 mikroliter lalu mencampurkan dengan 50 mikroliter sample DNA

9.      Mengambil sebanyak 25 mikroliter mencampurkan sample diatas kemudian memasukan kedalam salah satu sumuran (1 kelompok mengisi 2 sumuran )

10.  Mengambil DNA ledder sebanyak 6 mikroliter lalu memasukan dalam salah satu sumuran

11.  Menyalakan power supply dan setting pada voltase 70-75 volt

12.  Menghubungkan elektrovoresis chamber dengan power supply, menunggu kurang lebih 1 jam 30 menit atau sampai bercak hamper berada diujung agarose

13.  Setelah itu mematikan power supply dan mengambil tray yang berisi agarose

14.  Memindahkan agarose kedalam ethidium bromida dan merenda selama 30 menit

15.  Setelah 30 menit mengambil agarose dan mencuci menggunakan aquades sebanyak 2 kali

16.  Mengamati menggunakan UV transluminator     

V.      Hasil pengamatan

A.    Ekstraksi DNA

B. elektroforesis

VI.   Pembahasan

A.    Ekstraksi DNA

            Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Pada praktikum isolasi DNA dilakukan isolasi terhadap jenis tanaman kelapa. Isolasi DNA ini dilakukan dengan melalui beberapa tahap yakni tahap pertama yakni menyiapkan CTAB buffer sebanyak 2x volume berat sample (1ml) dan memasukan ke dalam incubator atau waterbath yang sudah disetting suhunya di 65^oC, penggunaan CTAB berfungsi untuk menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi.

            Kemudian tahap ke dua adalah mengambil daun kelapa lalu menimbang beratnya sebanyak 0,5 gram memasukan daun kedalam mortar lalu menambahkan nitrogen cair dan digerus sampai halus, hal ini dilakukan agar pada saat penghancuran mudah dihancurkan menjadi partikel-partikel kecil, kemudian memasukan kedalam mortar dan menambahkan nitrogen cair kemudian menggerusnya hingga halus, hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan , proses ini harus dilakukan dengan hati-hati sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA, penggerusan ini menggunakan nitrogen cair dengan tujuan untuk memekatkan DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na+ mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na+ berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul.

            Kemudian tahap selanjutnya yakni Memasukan serbuk daun tersebut menggunakan spatula kedalam tabung eppendorf yang berisi CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi. buffer kemudian memvortex sebentar, vortex berfungsi untuk menghomogenkan. Kemudian penambahan CIAA yang berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA.

            Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas berbagai enzim nuclease. Maka diperoleh sampel DNA dengan adanya benang-benang tipis pada sample yang dapat diperkirakan itu merupakan pita DNA.

B.     Elektroforesis

                  Pada praktikum kali ini melakukan percobaan elektroforesis pada sample DNA daun kelapa, tahap pertama pada praktikum kali ini yakni pembuatan gel agarose dengan cara yakni menimbang agarose sebanyak 1 gram, mencampurkan agarose dengan TBE buffer sebanyak 100 ml (agarose 1%) di dalam erlenmeyer, menimbang dan mencatat beratnya . lalu memasak agarose menggunakan microwave setelah matang menimbang lagi beratnya, jika berkurang tambahkan TBE buffer sampai mencapai berat semula memasukan agarose 1% tadi kedalam cetakan/tray yang sudah dipasang comb tunggu sampai benar-benar padat kemudian tahap selanjutnya yakni memasukan agarose beserta tray nya kedalam elektroforesis chamber (mengusahakan jangan terbalik posisinya ujung agarose yang ada sumurannya harus berada didepan kutub negatife) lalu menambahkan TBE buffer sampai batas yang sudah ditentukan TBE buffer berfungsi untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik.

                  Kemudian mengambil loading buffer sebanyak 12 mikroliter lalu mencampurkan dengan 50 mikroliter sample DNA yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru, mengambil DNA ledder sebanyak 6 mikroliter lalu memasukan dalam salah satu sumuran, Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 70-75 Volt selama 1 jam 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil . Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna. Pada tahap dokumentasi hal yang pertama memindahkan agarose kedalam ethidium bromida dan merendam selama 30 menit.

                  Setelah 30 menit mengambil agarose dan mencuci menggunakan aquades sebanyak 2 kali. Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan sinar UV dan kamera. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software. Tetapi pada percobaan kali ini kami tidak mendapatkan adanya DNA pada hasil percobaan hal ini dikarenakan adanya kesalahan pada tahap percobaan yakni pada tahap memasukan sampe DNA ke sumuran, pada saat itu banyak dari sample yang meluber hal ini menyebabkan DNA larut keluar sehingga tidak terdeteksi pada alat pendeteksi .

VII.Kesimpulan

1.      DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme.

2.      DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoxiribosa, basa nitrogen dan zat yang tergabung membentuk nukleotida.

3.      Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.

4.      Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel agarose.

5.      Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi linier.

6.      Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.

Daftar Pustaka

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM. Yogyakarta

Lehninger,  A.L. 1982. Dasar – dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta

Michel Peyrard, Nonlinear Dynamics and Statistical Physics of DNA, 2004

Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta